LOVO/5FU人結(jié)直腸癌細(xì)胞氟尿嘧啶耐藥株

細(xì)胞介紹

注：本培養(yǎng)基是不直接添加氟尿嘧啶藥物的。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：結(jié)直腸腺癌

2） 形態(tài)：上皮樣   貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用,。

LOVO/5FU人結(jié)直腸癌細(xì)胞氟尿嘧啶耐藥株

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系,。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作,。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況,。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL,，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理,。傳代過(guò)程中,，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

（1）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%,；二氧化碳,，5%。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

（2）*培養(yǎng)基的配制：

①準(zhǔn)備F12K（推薦0007) 培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%,；雙抗,，1%；補(bǔ)充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積,。

②準(zhǔn)備F12K含5-Fu*培養(yǎng)基：優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%；雙抗,，1%,；5-Fu：400~1065uM；補(bǔ)充F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基至所需體積,。

（3）凍存液：90%血清,，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

注意：

① 細(xì)胞在傳代和剛復(fù)蘇時(shí)較為脆弱,，中止液須為不含5-Fu的*培養(yǎng)基，且在細(xì)胞未貼壁期間和貼壁前期需用不含5-Fu的*培養(yǎng)基,，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)再根據(jù)需要濃度添加5-Fu,。

②若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢時(shí)，可適當(dāng)降低5-Fu的濃度,，或使用不含5-Fu的*培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí),，再更換為所需的5-Fu濃度。

二,、細(xì)胞培養(yǎng)

（1）細(xì)胞復(fù)蘇

①將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃,；

②準(zhǔn)備一支15ml離心管，加入5mL含10%FBS的*培養(yǎng)基,，放入37℃水浴鍋中預(yù)熱,；

③戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后,，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞,，盡快轉(zhuǎn)入37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；

④將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中,，混勻后，1000rpm離心5min；

⑤準(zhǔn)備一個(gè)T25培養(yǎng)瓶,，寫(xiě)上細(xì)胞名稱,、日期，再加入4mL*培養(yǎng)基,；

⑥離心完成后棄去上清,，用1mL*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)中,，混勻后轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置,。

注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入,，需擰松凍存管,，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管,，置于干冰上,，然后放入37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸,。

（2）細(xì)胞傳代

①當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí),，可進(jìn)行傳代；

②在生物安全柜內(nèi),，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口,，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；

③向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3mL無(wú)菌的1×PBS 后,，水平放置培養(yǎng)瓶,，使PBS能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄PBS,；

④向瓶?jī)?nèi)加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶）,，浸潤(rùn)底面后放入37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育3~5min；

⑤孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起,，若全部消化下來(lái)則直接向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入2mL含10%FBS的*培養(yǎng)基中,，將懸液吸入15mL離心管；

注意：如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái),，可采用分步消化：

a. 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的15mL離心管,，加入2mL含10%FBS的*培養(yǎng)基；

b.將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）,；

c.向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化2min左右,，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入2mL含10%FBS的*培養(yǎng)基中和,，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi),。

⑥1000rpm離心5min,；

⑦準(zhǔn)備兩個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶，各加入4mL*培養(yǎng)基,；

⑧離心完成后,，棄上清，用2mL*培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞,，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2個(gè)T25培養(yǎng)瓶,，每個(gè)培養(yǎng)瓶各1mL；

⑨水平放置培養(yǎng)瓶,，震蕩混勻后將培養(yǎng)瓶置于37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

（3）細(xì)胞凍存  （注意：細(xì)胞凍存建議每瓶T25凍一支）

①~⑥請(qǐng)參照傳代步驟,；

⑦離完成后,，棄上清，用1mL凍存液重懸細(xì)胞沉淀,，然后轉(zhuǎn)入1.8mL凍存管中,；

⑧將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過(guò)夜降溫,；

⑨第二天,，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存,。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系,。

2.收到細(xì)胞先不開(kāi)瓶蓋,，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片,，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài),，100*,，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況,。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù),。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài),，故客戶需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明,，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。